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如何通過原位精準編輯大幅增強目標基因的表達？2024年7月23日，上海交通大學陸鈺明教授課題組聯(lián)合南方科技大學朱健康院士團隊，在Molecular Plant在線發(fā)表了題為“Efficient and multiplex gene upregulation in plants through CRISPR/Cas-mediated knock-in of enhancers”的研究論文。該研究將全新的全基因組增強子挖掘技術（STEM技術）與基因敲入技術結合，在植物上建立了一種可通用（30+各類基因的激活）、可設計（3-1000倍增強）、可遺傳（>T3代的驗證）的基因激活技術。通過一次敲入實驗，該技術進一步實現(xiàn)了對整個NMN代謝通路多達4個基因的同時激活，首次將植物內源性NMN含量提升了2-3倍，為基因過表達提供了一種替代轉基因的通用解決方案。
基因表達的精準調控對于物種改良至關重要，通常依賴于轉基因技術。隨著CRISPR/Cas介導的敲入技術的發(fā)展，精確地在植物基因組中插入序列成為可能。如果能夠實現(xiàn)有針對性地將增強子插入基因的啟動子區(qū)域，實現(xiàn)直接增強轉錄的“原位激活”，則有望克服對轉基因的依賴和隨機性編輯的局限。但適合精確敲入的短轉錄增強子（STEs）的短缺限制了其在植物育種中的應用。符合監(jiān)管政策的短序列、高效的內源性STEs的需求迫切，但目前相關研究非常有限
區(qū)別于Starr-seq技術，該研究首先開發(fā)了一種名為STEM的一種高通量篩選增強子的方法。為了大規(guī)模地從物種基因組中篩選出具有不同調控能力的增強子，該研究提供了一種含條形碼載體系統(tǒng)，將每個條形碼與候選增強子元件一一對應，通過測量條形碼的豐度，獲得候選增強子元件的激活倍數(shù)?；赟TEM，通過分析水稻基因組中關鍵候選基因的啟動子區(qū)域，研究團隊鑒定了11610個候選STEs，并利用條形碼介導的RNA-seq分析，成功鑒定了122個來自病毒及水稻的短增強子，其中來自病毒的增強子最高能夠達到1000倍的激活效果，來自水稻內源的增強子最高能夠達到66.6倍的激活效果，其中最短的增強子長度為40bp，大多數(shù)集中在100bp。該研究通過體外實驗確定了STE插入的最佳位置，發(fā)現(xiàn)越接近轉錄起始位點（TSS），增強效果越強。在水稻多個不同基因中進行的目標敲入實驗中，實現(xiàn)了高達176倍和869.1倍的基因表達上調，且該上調效果在多代中穩(wěn)定遺傳。
此外，為了驗證梯度激活的可行性，該研究選擇了四個具有不同激活能力的STEs，包括來自病毒的STEvs011和STEvs007，以及水稻衍生的STEos026和STEos045。通過將這些STEs的供體DNA片段混合并轉化水稻愈傷組織，研究人員成功獲得了不同STEs插入的水稻T0代植株，并觀察到EUI和RFT1基因表達的梯度上調。與此同時，研究人員還探討了同時激活多個基因的可能性。以煙酰胺單核苷酸（NMN）生物合成途徑為例，研究人員設計了六個相關基因的sgRNA位點，并構建了相應的CRISPR/Cas9質粒。通過單次轉化，研究人員成功實現(xiàn)了多達四個基因的同時激活，并顯著增強了NMN代謝途徑。
該研究通過開發(fā)一種創(chuàng)新的全基因組篩選方法STEM，實現(xiàn)了短轉錄增強子（STEs）的高效篩選，并在水稻中成功應用了“原位激活”技術。此外，該研究證實了通過“原位激活”技術實現(xiàn)的基因上調效果在多代植物中具有穩(wěn)定的遺傳性，解決了傳統(tǒng)轉基因技術中常見的代際不穩(wěn)定性問題，通過使用不同STEs實現(xiàn)了目標基因表達的梯度調控，通過單次轉化實現(xiàn)多個基因的同時激活，這為復雜性狀的精細調控和改良提供了新的可能性。該工作強調了對高效、短序列、具有特定活性的內源性STEs的進一步研究的必要性。未來通過探索STEs的時空特異性表達調控機制，將為植物遺傳改良提供更為精確的工具。鑒于基因組編輯技術相較于傳統(tǒng)轉基因技術在監(jiān)管政策上的優(yōu)勢，該研究為符合政策導向的作物改良提供了新的思路。
姚琦博士、沈潤東博士和邵揚博士為共同第一作者，陸鈺明教授和朱健康院士為本文通訊作者，田益夫博士、韓沛津博士、張學寧博士也參與了該研究。該研究得到了科技部重點研發(fā)計劃青年項目、上海市農業(yè)科技創(chuàng)新項目和國家自然科學基金項目資助。
值得注意的是，陸鈺明課題組也在今年5月份在New Phytologist發(fā)表了題為“In-locus gene silencing in plants using genome editing”的研究論文，成功開發(fā)了“原位沉默”技術。通過在5’UTR區(qū)敲入一種多功能調控元件ATGE，該方法可通過一次敲入實驗，獲得具有不同敲低程度的基因編輯材料，從而建立了一種高效率、可遺傳、非轉基因的新型基因沉默技術。結合該團隊獨特的敲入技術(Nature Biotechnology 38:1402)，其已成功建立了完全自主的基因編輯育種體系，實現(xiàn)了低至10%、高達1000倍，可通用、可設計、可遺傳的基因原位調控。
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